I. Introduction
Les logiciels que nous allons utiliser
sont majoritairement issus de la suite EMBOSS (EMBOSS
homepage). Ils sont disponible à plusieurs endroits :
Pour ce TP, nous allons utiliser EMBOSS Explorer sur le site de Wageningen Bioinformatics (centre de bioinformatiques de Wageningen), au Pays-bas. Nous verrons l'utilisation de Galaxy plus tard dans le module.
Dans l'interface EMBOSS Explorer, vous obtenez l'aide en suivant le lien read 'the manual'.
Il existe deux modes, l'un simple, l'autre dit avancée. Dans la version simple, seuls quelques paramètres peuvent être modifiés, les autres étant choisis par défaut. Nous utiliserons systématiquement la version avancée.
II. Recherches avec le dotplot et les outils d'alignement
II-1. Premiers tests
Nous allons principalement utiliser tout au long de ce TP les 4
logiciels suivants : dotpath,
dotmatcher, stretcher et
matcher. Il est conseillé d'ouvrir un logiciel
par onglet de votre navigateur et ne les fermer qu'à la fin du TP.
Nous allons utiliser deux logiciels pour
effectuer les dotplots :
- dotpath qui permet de dessiner un dotplot avec
une taille de fenêtre fixée (param.=windowsize) ;
- dotmatcher qui permet de filtrer les fenêtres
avec un seuil (param.=threshold).
Et les deux autres pour les alignements :
- stretcher pour l'alignement global ;
- matcher pour l'alignement local.
Aller sur EMBOSS Explore et regarder les différentes logiciels qui sont mis à disposition (mode simple/avancé, manuel, options, ...).
Préparer votre navigateur pour l'utilisation de ces 4 logiciels.
II-2. Introns / exons
Essayer le logiciel dotpath
avec la taille de fenêtre par défaut et en sélectionnant ou déselectionnant l'option 'Display the overlapping matches'. Essayer avec
d'autres tailles de fenêtre.
En déselectionnant l'option 'Display the overlapping
matches', vous demandez au logiciel de ne conserver que les
fenêtres non chevauchantes.
Que constatez-vous ?
En fait, la première séquence est l'ADN d'un
gène de l'actine chez Xenopus laevis et la seconde l'ADNc de ce
même gène.
Combien le gène compte-t-il d'exons ?
Essayer le logiciel
dotmatcher avec les paramètres par
défaut. Faites varier le paramètre de seuil jusqu'à retrouver le
résultat obtenu avec dotpath.
Les matrices disponibles dans EMBOSS se trouvent
ici.
Jouez sur le paramètre de la matrice de
score et observez le résultat.
Le seuil, ou threshold, en paramètre de
dotmatcher correspond au score d'alignement au delà duquel la fenêtre
est affichée. C'est pour cela qu'en faisant varier les matrices on
obtient des dotplots différents.
Pour repérer exactement les sites d'épissage,
faites un alignement global de ces deux séquences avec
stretcher. Testez ce logiciel en fixant comme
pénalité d'ouverture de gap 12 et comme pénalité d'extension de gap
1.
Que retrouvez-vous ?
À quelles positions se trouvent les introns et
les exons ?
Cela est-il cohérent avec les données contenues
dans la
fiche GenBank de cette séquence ?
II-3. Séquence nucléique / séquence protéique
Nous allonst maintenant aborder un exemple
chez l'homme et la souris : les séquences nucléiques et protéiques
des gènes pl6.
Construisez le dotplot des séquences ADN puis
le dotplot des séquences protéiques avec
dotmatcher.
Sur quel type de séquence la similarité
est-elle la plus visible ?
Comparez maintenant les séquences avec
l'algorithme d'alignement global stretcher.
Notez les pourcentages de similarité dans chaque cas.
Sur quel type de séquence la similarité
est-elle la plus visible ?
Conclusion ?
II-4. Conservation de domaine
Vous allez maintenant comparer deux autres
séquences: ce sont deux facteurs de transcription
krox 24 et
sp1, contenus dans les fichiers
krox24.seq et
sp1.seq.
Construisez un dotplot avec
dotmatcher de ces deux séquences.
Vous devez observer une similarité locale :
c'est un motif doigt de zinc, impliqué dans la liaison à l'ADN.
Comparez ensuite les deux séquences avec un
alignement local en utilisant matcher. Retrouver le
résultat précédent.
Vérifiez dans les fiches de ces deux séquences les bornes exactes des motifs
doigt de zinc dans chacune d'elle :
krox24 et
sp1
II-5. Analyse d'une séquence
Le dotplot peut également être utilisé pour
étudier les régularités structurelles d'une séquence. Vous allez
tester cette approche sur les deux exemples suivants.
1. Localisation de répétitions :
Analysez avec
dotpath la
séquence de rétrotransposon de tabac contenue dans le fichier
ben2.seqn (activez l'option 'Display the
overlapping matches').
En jouant sur le
paramètre de taille de fenêtre, identifiez le nombre de répétitions
significatives ?
Coupez votre séquence en deux tel que chaque
moitié contienne une répétition. Faite un alignement local avec
matcher de ces 2 moitiés pour identifiez plus
précisément le motif répété.
2. Faible complexité :
Pour illustrer la présence de régions de
faible complexité, nous allons étudier la séquence contenue dans le
fichier
falciparum.seq avec
dotmatcher. En faisant varier les paramètres, vous
devez observer quatre tâches.
À quoi cela correspond-il ?
II-6. Programmation dynamique live
Vous pouvez jeter un coup d'oeil sur
ce
site web si votre ordinateur vous le permet (Applet Java)....
Il permet de réaliser un calcul d'alignement local, de
visualiser la matrice de programmation dynamique et le backtracking.
Changez les séquences et les paramètres. Par
exemple, reprenez les données de l'exercice 2 du TD1.
III. Significativité des scores
Le logiciel prss permet
de tester la significativité entre deux séquences. Il
crée une séquence aléatoire de même composition que la seconde
séquence fournie et effectue un algorithme d'alignement. Il répète
cela plusieurs fois.
Recupérer le fichier
test qui contient 2 séquences relativement éloignées. Testez
prss avec ces deux séquences.
Pour lire le résultat, il faut trouver le
score d'alignement entre les 2 séquences, généralement en dessous de
s-w (pour smith-waterman) et le nombre attendu de
fois où le score d'alignement avec une séquence mélangée dépasse ce
score, généralement pas loin, en dessous de E(nombre).
Le résultat est-il celui attendu ?
Refaites le même test mais avec deux
séquences proches (par exemple avec les séquences protéiques d'homme
et de souris de l'
exercice II-3).
IV. Enzymes TPP - Thiamine Phosphate dependent enzymes - (FACULTATIF)
Afin d'avoir une idée de la ressemblance
entre ces séquences, effectuez un dotplot avec
dotpath.
IV-1. Pénalités associées aux gaps
Effectuez un alignement global avec le
logiciel stretcher en prenant comme paramètres :
pénalité d'ouverture de gap = 2, pénalité d'extension de gap = 2,
matrice de scores = EPAM60.
Enregistrez le fichier résultat et retenez la
valeur du score et du % d'identité (ou plus simplement laissez cet
onglet ouvert et effectuez la prochaine recherche dans un autre
onglet).
L'alignement obtenu est spécifique aux
valeurs de paramètres.
Effectuez maintenant un alignement global
avec le logiciel stretcher en prenant comme
paramètres : pénalité d'ouverture de gap = 12, pénalité d'extension de
gap = 2, matrice de scores = EPAM60. Comparez le résultat avec
l'alignement précédent.
Quelles différences remarquez-vous ?
Quelle est celui des deux alignements qui vous paraît le plus
pertinent ?
Nous voyons ici l'effet des fonctions de
gaps. D'autre part, cela met en évidence qu'un alignement de meilleur
score n'est pas forcément le meilleur alignement entre deux
séquences.
IV-2. Alignement local
Les alignements locaux sont souvent plus
utiles que les alignements globaux. Les séquences proches partagent le
plus souvent des régions similaires et non leur totalité.
Nous allons tenter d'identifier si un
fragment inconnu de protéine est relatif à la protéine
précédente ILV1_TOBAC.
Effectuez un alignement global avec
stretcher entre ce peptide et ILV1_TOBAC avec comme
paramètres la matrice de score EBLOSUM45 et le jeu de pénalités de gaps
12/2.
Que pensez-vous de cet alignement ?
Comment expliquez-vous ce résultat ?
Faites maintenant un alignement local avec
matcher avec les mêmes paramètres. Choisissez de voir
les 10 meilleurs alignements locaux (paramètre 'Number of alternative matches'). Observez combien des alignements de scores proches ou identiques peuvent être différents.
Afin de vérifier si ces alignements locaux sont pertinents, il faudrait rechercher les domaines correspondant aux séquences traitées. Vous verrez cela dans les cours et TP suivants.
IV-3. Alignement local avec des protéines de taille similaire
Faites un alignement local avec matcher entre ILV1_TOBAC et ILVB_ARATH (matrice EBLOSUM62, gaps 12/2, 10 alignements).
Que dire du premier alignement ?
Les autres alignements permettent de mettre en avant quelques conclusions trop hatives qui pourraient être faites à partir des résultats d'un alignement local.
Observez les alignements numéro 6 et 8. Comparez leurs scores, leurs pourcentages d'identité et leurs longueurs.
Quelles conclusions peut-on en tirer ?
IV-4. Matrices de score (A FAIRE APRES LE CM2 lors de la séance de TP du 7/02)
Les séquences précédentes (ILV1_TOBAC et
ILVB_ARATH) sont de la famille des enzymes Thiamine Pyrophosphate
(TPP). PDC1 est également de cette famille mais plus éloignée.
Effectuez un alignement global entre
ILVB_ARATH et PDC1_MAIZE avec stretcher avec comme
paramètres : matrice=EBLOSUM62, ouverture de gap=12, extension de
gap=2.
Remarquez combien le score de cet alignement et
le pourcentage d'identité sont faibles.
Pensez-vous que ce soit
un bon alignement ?
Pensez-vous que la matrice BLOSUM62 soit
adéquat dans ce cadre ?
Quelle matrice pourrait être meilleure
? Pourquoi ?
Refaites cet alignement avec une matrice
que vous pensez être meilleure. (
Les matrices disponibles dans EMBOSS se trouvent ici)
Qu'en pensez-vous ?
Essayons avec les matrices PAM.
Construisez les alignements avec EPAM30 et EPAM350.
Quel est le meilleur alignement ?
Était-ce
prévisible ?
En confrontant les résultats de
l'alignement avec les structures secondaires, on dispose d'un critère
de décision supplémentaire pour juger de la validité d'un
alignement.
Il faut retenir que les matrices de scores affectent les résultats
d'un alignement et qu'il est difficile de juger de la qualité d'un
alignement de deux séquences. Le choix de la matrice dépend de la
divergence qu'ont les deux séquences étudiées, les meilleurs résultats
étant obtenus lorsque on utilise la matrice la plus sensible par
rapport au niveau de divergence réel des séquences.
